８．酵 素 抗 体 法

１．4μm切片（シランコートスライド）をふ卵器で一晩、乾燥・貼り付け
２．脱パラ水洗：キシレン１５分⇒下降アルコール⇒水洗
３．蒸留水洗浄　１回
４．２％過酸化水素加PBS、室温１０分
５．５分の流水洗浄後、軽く蒸留水で洗浄
６．必要に応じ、抗原の賦活化（賦活化法は、免疫染色マニュアル参照）
７．ＰＢＳ洗浄３回　各１分
８．組織周囲のPBSを、キムワイプでふき取る（乾燥に注意）
９．６％正常ヤギ血清を滴下し、ブロッキング　室温１０分
１０．キムワイプで、ヤギ血清を拭き取る（乾燥に注意）
１１．一次抗体 約 100μlを滴下し、イエローチップで攪拌　室温３０分
１２．洗浄瓶のPBSで抗体を洗い落とす。その後、PBS洗浄３回各１分
１３．組織周囲のPBSを、キムワイプでふき取る（乾燥に注意）
１４．HRP-Rabbit / Mouse Envisionを２滴滴下し、イエローチップで攪拌室温３０分
１５．洗浄瓶のPBSで抗体を洗い落とす。その後、PBS洗浄３回各１分
１６．窒化ナトリウム加DAB液に浸漬し、発色を随時観察　
１７．適当な時、PBSで、発色反応を停止
１８．ｺﾝﾄﾛｰﾙ標本をﾁｪｯｸする。（必要に応じ、１6番のDAB反応を追加する）
１９．流水洗浄
２０．核染色（ﾏｲﾔｰﾍﾏﾄｷｼﾘﾝ）３０～６０秒
２１．水洗
２２．0.3％HCIに３秒程度浸し、分別。（薄目に染めること）
２３．流水水洗し、色だし　１分以上（核が、赤紫から青くなるまで）
２４．脱水・封入

注意１：9番、11番の抗体を滴下する前に、組織周囲のPBSを拭き取ること。
注意２：抗体滴下後、ﾏｲｸﾛﾋﾟﾍﾟｯﾄのﾁｯﾌﾟで、抗体を充分に攪拌すること。

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