７．蛍光抗体法

直接蛍光抗体法（IgG・A・M・C1q・C3・Fib）

１． シランコートスライドに4μｍ凍結切片を各抗体につき連続切片で3枚ずつのせる
　　　　　　　腎…IgG・A・M・C1q・C3・Fibの6種類　★糸球体が最低1つずつ必要
　　　　　　　皮膚…IgG・A・M・C1q・C3・Fibの6種類　★上皮と基底膜がでるように
２． スライドたてにのせすぐに冷風乾燥（ファンをつけておく）…約30分
３． －20℃冷凍庫から抗体を出し暗所で解凍する
４． プラスチックスピッツに抗体をデカントで移し遠心分離する…3000rpm　3分
５． 新しいスピッツに上清のみデカントで移す（使用時まで冷蔵庫内で保存）
６． 乾燥したスライドに抗体名と標本番号を記載し染色かごに入れる
７． アセトン固定…5～7分
８． 冷PBSで5分ずつ3回洗浄　　　　　　　★アセトンから移すときに乾燥注意！！
９． キムワイプで組織周囲のPBSをふき取る　　　　★組織の乾燥に注意！！
１０． スライドに抗体を満載する…湿潤箱（箱の上に紙をかぶせ遮光する）室温1時間
１１． 冷PBSで5分ずつ3回洗浄（5分の間は冷蔵庫に入れる）
１２． 蒸留水で水洗
１３． ゲルマウントで封入する　　　　　　　　　　★あまり光にあてないように！！
１４． 鏡検・写真撮影まで冷暗所で保存

間接蛍光抗体法（C4ｄ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　平成２０年６月２０日改訂

１． シランコートスライドに4μｍ凍結切片を各抗体につき連続切片で3枚ずつのせる
２． スライドたてにのせすぐに冷風乾燥（ファンをつけておく）…10分
３． 冷PBSで10分ずつ2回洗浄
４． キムワイプで組織周囲のPBSをふき取る　　　　★組織の乾燥に注意！！
５． 冷10％正常ウサギ血清（NRS）を100μlのせる…湿潤箱　室温20分
６． キムワイプで10％NRSをふき取る
７． 抗C4d抗体(5％NRSで100倍希釈)200μlのせる…4℃　overnight
８． 冷PBSで5分・10分・15分・30分ずつ合計60分洗浄する（冷蔵庫に入れる）
９． FITC標識Rabbit抗Mouse IgG抗体(5％NRSで10倍希釈)を300μlのせる
　　…湿潤箱（箱の上に紙をかぶせ遮光する）　室温1時間
１０． 冷PBSで10分ずつ2回洗浄（10分の間は冷蔵庫に入れる）
１１． 蒸留水で水洗
１２． ゲルマウントで封入する　　　　　　　　★あまり光にあてないように！！
１３． 鏡検・写真撮影まで冷暗所で保存

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